PCR ئىنكاسىدىكى ئارىلىشىش ئامىللىرى

PCR ئىنكاسى جەريانىدا ، بەزى ئارىلىشىش ئامىللىرى دائىم ئۇچرايدۇ.
PCR نىڭ سەزگۈرلۈكى ئىنتايىن يۇقىرى بولغانلىقتىن ، بۇلغىنىش PCR نەتىجىسىگە تەسىر كۆرسىتىدىغان ئەڭ مۇھىم ئامىللارنىڭ بىرى دەپ قارىلىدۇ ۋە يالغان ئاكتىپ ئۈنۈم ھاسىل قىلالايدۇ.
ئوخشاشلا ھالقىلىق مەنپىي نەتىجىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان ھەر خىل مەنبەلەر. ئەگەر PCR ئارىلاشمىسىنىڭ بىر ياكى بىر قانچە مۇھىم قىسمى ياكى كۈچەيتمە رېئاكسىيەنىڭ ئۆزى توسقۇنلۇققا ئۇچرىسا ياكى ئۇنىڭغا دەخلى قىلسا ، دىئاگنوز قويۇشقا توسالغۇ بولىدۇ. بۇ ئۈنۈمنىڭ تۆۋەنلىشىنى ، ھەتتا يالغان پاسسىپ نەتىجىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.
چەكلەشتىن باشقا ، ئەۋرىشكە تەييارلاشتىن ئىلگىرى توشۇش ۋە ياكى ساقلاش شارائىتى سەۋەبىدىن نىشانلىق يادرو كىسلاتاسىنىڭ مۇكەممەللىكى يوقىلىشى مۇمكىن. بولۇپمۇ يۇقىرى تېمپېراتۇرا ياكى ساقلاشنىڭ يېتەرلىك بولماسلىقى ھۈجەيرە ۋە يادرو كىسلاتاسىنىڭ بۇزۇلۇشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن. ھۈجەيرە ۋە توقۇلمىلارنى ئوڭشاش ۋە پارافىن قىستۇرۇش DNA نىڭ پارچىلىنىشى ۋە ساقلىنىۋاتقان مەسىلە ھەممىگە ئايان (1-ۋە 2-رەسىملەرگە قاراڭ). بۇ خىل ئەھۋال ئاستىدا ، ھەتتا ئەڭ ياخشى يەكلەش ۋە تازىلاشمۇ پايدىسى يوق.

رەسىم 1 | ھەرىكەتسىزلىنىشنىڭ DNA پۈتۈنلۈكىگە بولغان تەسىرى
ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورىسى شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، جەسەت تەكشۈرۈشنىڭ پارافىن بۆلەكلىرىدىن ئايرىلغان DNA نىڭ سۈپىتى بىر قەدەر ئوخشىمايدۇ. جەۋھەرلەردە ئوڭشاش ئۇسۇلىغا ئاساسەن ئوخشىمىغان ئوتتۇرىچە ئۇزۇنلۇقتىكى DNA بار. يەرلىك توڭلىتىلغان ئەۋرىشكە ۋە بۇففېرلىق نېيترال فورمالىندا مۇقىملاشتۇرۇلغاندىلا ئاندىن DNA ساقلانغان. كۈچلۈك كىسلاتالىق بوئىننى ئوڭشايدىغان ياكى توسالغۇسىز ، فورما كىسلاتالىق فورمالىننى ئىشلىتىش DNA نىڭ كۆرۈنەرلىك يوقىلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقاردى. قالغان قىسمى ناھايىتى پارچىلىنىپ كەتكەن.
سول تەرەپتە پارچىلارنىڭ ئۇزۇنلۇقى كىلوباس جۈپ (kbp) بىلەن ئىپادىلىنىدۇ

رەسىم 2 | يادرو كىسلاتا نىشانىنىڭ مۇكەممەللىكىنى يوقىتىش
(a) ھەر ئىككى تالدىكى 3′-5 ′ بوشلۇق نىشاندىكى DNA نىڭ بۇزۇلۇشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ. كىچىك بۆلەكتە DNA نىڭ بىرىكىشى يەنىلا كۆرۈلىدۇ. قانداقلا بولمىسۇن ، ئەگەر DNA بۆلەكلىرىدە دەسلەپكى قەدەمدە ئۇلاش ئورنى كەم بولسا ، پەقەت سىزىقلىق كۈچەيتىش يۈز بېرىدۇ. ئەڭ پايدىلىق ئەھۋالدا ، پارچىلار بىر-بىرىنى ئەسلىگە كەلتۈرۈشى مۇمكىن ، ئەمما مەھسۇلات مىقدارى كىچىك ۋە بايقاش سەۋىيىسىدىن تۆۋەن بولىدۇ.
(2) بازىنىڭ يوقىلىشى ، ئاساسلىقى چۈشكۈنلىشىش ۋە تىمىدېن دىمېرنىڭ شەكىللىنىشىدىن كېلىپ چىققان بولۇپ ، H زايومنىڭ سانىنىڭ ئازىيىشىنى ۋە Tm نىڭ تۆۋەنلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ. ئۇزۇنغا سوزۇلغان ئىسسىنىش باسقۇچىدا ، پىرىزما ماترىسسا DNA دىن ئېرىپ كېتىدۇ ، ھەتتا قاتتىق شارائىتتامۇ يانمايدۇ.
(3) يانداش تايمىن بازىسى TT ۋاقىت سىزىقىنى شەكىللەندۈرىدۇ.
مولېكۇلا دىئاگنوز قويۇشتا دائىم كۆرۈلىدىغان يەنە بىر مەسىلە ، فېنول-خلوروفورم ئېلىشقا سېلىشتۇرغاندا نىشان يادرو كىسلاتاسىنىڭ ئەڭ ياخشى قويۇپ بېرىلىشى. پەۋقۇلئاددە ئەھۋاللاردا ، بۇ يالغان سەلبىي تەرەپلەر بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولىدۇ. لىزنى قاينىتىش ياكى ھۈجەيرە ئەخلەتلىرىنىڭ فېرمېنتلىق ھەزىم قىلىش ئارقىلىق نۇرغۇن ۋاقىتنى تېجەپ قالغىلى بولىدۇ ، ئەمما بۇ ئۇسۇل يادرو كىسلاتاسىنىڭ قويۇپ بېرىلىشى يېتەرلىك بولمىغاچقا ، PCR سەزگۈرلۈكىنى تۆۋەنلىتىدۇ.

كېڭەيتىش جەريانىدا پولىمېرازا پائالىيىتىنى چەكلەش

ئادەتتە ، چەكلەش كونتېينېر ئۇقۇمى سۈپىتىدە قوللىنىلىپ ، تۆۋەن دەرىجىدىكى PCR نەتىجىسىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان بارلىق ئامىللارنى تەسۋىرلەيدۇ. قاتتىق بىئوخىمىيىلىك مەنىدە ، چەكلەش فېرمېنتنىڭ پائالىيىتى بىلەنلا چەكلىنىدۇ ، يەنى ئۇ DNA پولىمېراسىنىڭ ئاكتىپ ئورنى ياكى ئۇنىڭ كوفاكتورىنىڭ ئۆز-ئارا تەسىر قىلىشى ئارقىلىق تارماق مەھسۇلاتنىڭ ئايلىنىشىنى ئازايتىدۇ ياكى ئالدىنى ئالىدۇ (مەسىلەن ، تاق DNA پولىمېراسىنىڭ Mg2 +).
ئەۋرىشكە تەركىبىدىكى تەركىبلەر ياكى ھەرخىل بۇففېرلار ۋە رېئاكتور بار جەۋھەرلەر فېرمېنتنى بىۋاسىتە تورمۇزلىيالايدۇ ياكى ئۇنىڭ كوفاكتورلىرىنى (مەسىلەن EDTA) تۇتىۋالىدۇ ، بۇ ئارقىلىق پولىمېرازا ئاكتىپسىزلىنىدۇ ۋە ئۆز نۆۋىتىدە PCR نەتىجىسىنىڭ تۆۋەنلىشى ياكى يالغانلىقىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.
قانداقلا بولمىسۇن ، رېئاكسىيە زاپچاسلىرى ۋە نىشاننى ئۆز ئىچىگە ئالغان يادرو كىسلاتاسى ئارىسىدىكى نۇرغۇن ئۆز-ئارا تەسىرلەرمۇ «PCR چەكلىگۈچ» قىلىپ بېكىتىلگەن. ھۈجەيرىلەرنىڭ مۇكەممەللىكى ئايرىۋېتىش ئارقىلىق بۇزۇلۇپ ، يادرو كىسلاتاسى قويۇپ بېرىلگەندىن كېيىن ، ئەۋرىشكە بىلەن ئۇنىڭ ئەتراپىدىكى ھەل قىلىش چارىسى ۋە قاتتىق باسقۇچ ئوتتۇرىسىدا ئۆز-ئارا تەسىر پەيدا بولىدۇ. مەسىلەن ، «تازىلاش ماشىنىسى» ئۆز-ئارا تەسىر قىلىش ئارقىلىق يەككە ياكى قوش لىنىيىلىك DNA نى باغلاپ ، ئاخىرىدا PCR رېئاكسىيە پاراخوتىغا يېتىپ بارىدىغان نىشان سانىنى ئازايتىش ئارقىلىق يەكلەش ۋە ساپلاشتۇرۇشقا دەخلى قىلالايدۇ.
ئادەتتە ، PCR چەكلىگۈچ كۆپىنچە بەدەن سۇيۇقلۇقى ۋە كلىنىكىلىق دىئاگنوز قويۇشتا ئىشلىتىلىدىغان سۈيدۈك (سۈيدۈكتىكى ئۇرېيە ، قاندىكى گېموگلوبىن ۋە گېپارىن) ، يېمەكلىك تولۇقلىغۇچىسى (ئورگانىك تەركىبلەر ، گلىكوگېن ، ماي ، Ca2 + ئىئون) ۋە مۇھىتتىكى تەركىبلەر (فېنول) دا بار. ، ئېغىر مېتاللار)

تېخىمۇ كەڭ تارقالغان PCR چەكلىگۈچ باكتېرىيە ۋە ئېۋكارىئوتىك ھۈجەيرىلەردە ، نىشانسىز DNA ، توقۇلما ماترىسسانىڭ DNA باغلايدىغان ماكرو مولېكۇلاسى ۋە پەلەي ۋە سۇلياۋ قاتارلىق تەجرىبىخانا ئۈسكۈنىلىرىدە ئۇچرايدۇ. ئېلىش جەريانىدا ياكى ئۇنىڭدىن كېيىن يادرو كىسلاتاسىنى تازىلاش PCR چەكلىگۈچنى يوقىتىشتىكى ئەڭ ياخشى ئۇسۇل.
بۈگۈنكى كۈندە ، ھەرخىل ئاپتوماتىك ئېلىش ئۈسكۈنىلىرى نۇرغۇنلىغان قولدا ياسالغان كېلىشىملەرنىڭ ئورنىنى ئالالايدۇ ، ئەمما نىشاننى% 100 ئەسلىگە كەلتۈرۈش ۋە ياكى تازىلاش ئەمەلگە ئاشۇرۇلمىدى. يوشۇرۇن چەكلىگۈچ يەنىلا ساپلاشتۇرۇلغان يادرو كىسلاتاسىدا بولۇشى مۇمكىن ياكى ئاللىبۇرۇن كۈچكە ئىگە بولۇشى مۇمكىن. چەكلىگۈچنىڭ تەسىرىنى ئازايتىش ئۈچۈن ئوخشىمىغان ئىستراتېگىيەلەر مەۋجۇت. مۇۋاپىق پولىمېرازانىڭ تاللىنىشى تورمۇزلاش پائالىيىتىگە كۆرۈنەرلىك تەسىر كۆرسىتىدۇ. PCR چەكلەشنى ئازايتىشنىڭ باشقا ئىسپاتلانغان ئۇسۇللىرى پولىمېرازا قويۇقلۇقىنى ئاشۇرۇش ياكى BSA قاتارلىق خۇرۇچلارنى ئىشلىتىش.
PCR ئىنكاسىنىڭ چەكلىنىشى ئىچكى جەريان سۈپىتىنى كونترول قىلىش (IPC) ئارقىلىق نامايان بولىدۇ.
ئېلىش زاپچاسلىرىدىكى ئېتانول ، EDTA ، CETAB ، LiCl ، GuSCN ، SDS ، ئىزوپروپانول ۋە فېنول قاتارلىق بارلىق رېئاكتور ۋە باشقا ھەل قىلىش چارىلىرىنى پاكىز يۇيۇش ئارقىلىق ئايرىۋېتىشكە دىققەت قىلىش كېرەك. ئۇلارنىڭ قويۇقلۇقىغا ئاساسەن ، ئۇلار PCR نى قوزغىتىشى ياكى چەكلىشى مۇمكىن.