PCR رېئاكسىيەسىدىكى ئارىلىشىش ئامىللىرى

PCR رېئاكسىيەسى جەريانىدا، بەزى توسالغۇ ئامىللىرىغا كۆپ ئۇچرايدۇ.
PCR نىڭ سەزگۈرلۈكى ئىنتايىن يۇقىرى بولغاچقا، بۇلغىنىش PCR نەتىجىسىگە تەسىر كۆرسىتىدىغان ئەڭ مۇھىم ئامىللارنىڭ بىرى دەپ قارىلىدۇ ھەمدە ساختا مۇسبەت نەتىجىلەرنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن.
يالغان مەنپىي نەتىجىلەرنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان ھەر خىل مەنبەلەر ئوخشاشلا مۇھىم. ئەگەر PCR ئارىلاشمىسىنىڭ بىر ياكى بىردىن ئارتۇق مۇھىم قىسمى ياكى كۈچەيتىش رېئاكسىيەسىنىڭ ئۆزى توسقۇنلۇققا ئۇچرىسا ياكى ئارىلاشسا، دىئاگنوز قويۇش سىنىقى توسقۇنلۇققا ئۇچرايدۇ. بۇ ئۈنۈمنىڭ تۆۋەنلىشىگە، ھەتتا يالغان مەنپىي نەتىجىلەرنىڭ كېلىپ چىقىشىغا سەۋەب بولۇشى مۇمكىن.
توسۇشتىن باشقا، ئۈلگە تەييارلاشتىن بۇرۇنقى توشۇش ۋە/ياكى ساقلاش شارائىتى سەۋەبىدىن نىشانلىق نۇكلېئىك كىسلاتانىڭ پۈتۈنلۈكى يوقىلىشى مۇمكىن. بولۇپمۇ يۇقىرى تېمپېراتۇرا ياكى يېتەرلىك ساقلىماسلىق ھۈجەيرىلەر ۋە نۇكلېئىك كىسلاتالارنىڭ بۇزۇلۇشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن. ھۈجەيرە ۋە توقۇلمىلارنىڭ بىكىلىشى ۋە پارافىننىڭ سىڭىپ كىرىشى DNA پارچىلىنىشىنىڭ ھەممىگە ئايان سەۋەبلىرى بولۇپ، داۋاملىق مەسىلە (1- ۋە 2- رەسىملەرگە قاراڭ). بۇ خىل ئەھۋاللاردا، ئەڭ ياخشى ئايرىش ۋە تازىلاشمۇ ياردەم بەرمەيدۇ.

1-رەسىم | ھەرىكەتسىزلىكنىڭ DNA پۈتۈنلۈكىگە تەسىرى
ئاگاروز گېلى ئېلېكتروفورېزى جەسەت تەكشۈرۈشىنىڭ پارافىن پارچىلىرىدىن ئايرىۋېلىنغان DNA نىڭ سۈپىتىنىڭ زور دەرىجىدە پەرقلىنىدىغانلىقىنى كۆرسەتتى. جەسەتنى بېكىتىش ئۇسۇلىغا ئاساسەن، ئېكىستراكتلاردا ئوخشىمىغان ئوتتۇرىچە پارچىلارنىڭ ئۇزۇنلۇقىدىكى DNA بار ئىدى. DNA پەقەت يەرلىك توڭلىتىلغان ئەۋرىشكىلەردە ۋە بۇففېرلىق نېيترال فورمالىندا بېكىتىلگەندىلا ساقلىنىپ قالغان. كۈچلۈك كىسلاتالىق بوئىننى بېكىتىش ياكى بۇففېرلانمىغان، فورمىك كىسلاتاسى بار فورمالىننى ئىشلىتىش DNA نىڭ زور دەرىجىدە يوقىلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقاردى. قالغان پارچىلار يۇقىرى دەرىجىدە پارچىلانغان.
سول تەرەپتە، پارچىلارنىڭ ئۇزۇنلۇقى كىلوبازا جۈپلىرى (kbp) بىلەن ئىپادىلىنىدۇ.

2-رەسىم | نۇكلېئىك كىسلاتا نىشانلىرىنىڭ پۈتۈنلۈكىنىڭ يوقىلىشى
(a) ئىككى تالنىڭ 3′-5′ ئارىلىقى نىشان DNA نىڭ ئۈزۈلۈشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ. كىچىك پارچىدا DNA نىڭ سىنتېزى يەنىلا يۈز بېرىدۇ. قانداقلا بولمىسۇن، ئەگەر DNA پارچىسىدا باشلانغۇچنىڭ قىزىتىش ئورنى يوق بولسا، پەقەت سىزىقلىق كۈچەيتىلىش يۈز بېرىدۇ. ئەڭ پايدىلىق ئەھۋالدا، پارچىلار بىر-بىرىنى قايتا تويۇندۇرۇشى مۇمكىن، ئەمما مەھسۇلات مىقدارى كىچىك ۋە بايقاش سەۋىيەسىدىن تۆۋەن بولىدۇ.
(b) ئاساسلارنىڭ يوقىلىشى، ئاساسلىقى تازىلىنىش ۋە تىمىدىن دىمېر شەكىللىنىشى سەۋەبىدىن كېلىپ چىقىدۇ، بۇ H باغلىنىش سانىنىڭ ئازىيىشى ۋە Tm نىڭ ئازىيىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ. ئۇزۇنغا سوزۇلغان قىزىتىش باسقۇچىدا، باشلانغۇچ ماددىلار ماترىتسا DNA دىن ئېرىپ كېتىدۇ ۋە قاتتىق بولمىغان شارائىتتىمۇ قىزىمايدۇ.
(c) قوشنا تىمىن ئاساسلىرى TT دىمېرىنى ھاسىل قىلىدۇ.
مولېكۇلا دىئاگنوز قويۇشتا كۆپ ئۇچرايدىغان يەنە بىر كۆپ ئۇچرايدىغان مەسىلە، فېنول-خلوروفورم ئېلىش بىلەن سېلىشتۇرغاندا، نىشانلىق نۇكلېئىك كىسلاتانىڭ قويۇپ بېرىلىشىنىڭ ئەڭ ياخشى ئەمەسلىكىدۇر. ئېغىر ئەھۋاللاردا، بۇ يالغان مەنپىي نەتىجە بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولۇشى مۇمكىن. قاينىتىپ ئېرىتىش ياكى ھۈجەيرە قالدۇقلىرىنى ئېنزىملىق ھەزىم قىلىش ئارقىلىق نۇرغۇن ۋاقىت تېجەپ قالغىلى بولىدۇ، ئەمما بۇ ئۇسۇل كۆپىنچە نۇكلېئىك كىسلاتانىڭ قويۇپ بېرىلىشى يېتەرلىك بولمىغاچقا، PCR سەزگۈرلۈكىنىڭ تۆۋەن بولۇشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.

كۈچەيتىش جەريانىدا پولىمېرازا پائالىيىتىنى چەكلەش

ئادەتتە، چەكلەش PCR نەتىجىسىنىڭ ئەڭ ياخشى بولماسلىقىغا ئېلىپ كېلىدىغان بارلىق ئامىللارنى تەسۋىرلەيدىغان بىر قاپ ئۇقۇمى سۈپىتىدە ئىشلىتىلىدۇ. پەقەت بىئوخىمىيىلىك مەنىدە، چەكلەش ئېنزىمنىڭ پائالىيىتى بىلەنلا چەكلىنىدۇ، يەنى ئۇ DNA پولىمېرازاسىنىڭ ئاكتىپ ئورنى ياكى ئۇنىڭ بىرلىكتە ئىشلەيدىغان فاكتورى (مەسىلەن، Taq DNA پولىمېرازاسى ئۈچۈن Mg2+) بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىش ئارقىلىق سۇبسترات-مەھسۇلاتنىڭ ئۆزگىرىشىنى ئازايتىدۇ ياكى توسىدۇ.
ئەۋرىشكىدىكى تەركىبلەر ياكى رېئاگېنتلارنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ھەر خىل بۇففېرلار ۋە ئېكىستراكتلار ئېنزىمنى بىۋاسىتە چەكلەيدۇ ياكى ئۇنىڭ بىرلىكتە ئىشلەيدىغان ئامىللىرىنى (مەسىلەن، EDTA) تۇتۇۋېلىپ، پولىمېرازانى ئاكتىپسىزلاندۇرۇپ، PCR نەتىجىسىنىڭ تۆۋەنلىشى ياكى يالغان مەنپىي بولۇشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.
قانداقلا بولمىسۇن، رېئاكسىيە تەركىبلىرى بىلەن نىشانلىق نۇكلېئىك كىسلاتالار ئوتتۇرىسىدىكى نۇرغۇن ئۆز-ئارا تەسىرلەر «PCR چەكلىگۈچىلىرى» دەپمۇ ئاتىلىدۇ. ھۈجەيرىنىڭ پۈتۈنلۈكى ئايرىش ئارقىلىق بۇزۇلغاندىن ۋە نۇكلېئىك كىسلاتا قويۇپ بېرىلگەندىن كېيىن، ئەۋرىشكە بىلەن ئۇنىڭ ئەتراپىدىكى ئېرىتمە ۋە قاتتىق فازا ئوتتۇرىسىدا ئۆز-ئارا تەسىر پەيدا بولۇشى مۇمكىن. مەسىلەن، «ئاشخانا»لار كوۋالېنتسىز ئۆز-ئارا تەسىر ئارقىلىق يەككە ياكى قوش زەنجىرلىك DNA نى باغلاپ، ئاخىرىدا PCR رېئاكسىيە قاچىسىغا يېتىپ بارىدىغان نىشانلارنىڭ سانىنى ئازايتىش ئارقىلىق ئايرىش ۋە تازىلاشقا توسقۇنلۇق قىلالايدۇ.
ئادەتتە، PCR چەكلىگۈچىلىرى كلىنىكىلىق دىئاگنوز قويۇش سىنىقىدا ئىشلىتىلىدىغان كۆپىنچە بەدەن سۇيۇقلۇقلىرى ۋە رېئاگېنتلاردا (سۈيدۈكتىكى كاربامىد، قاندىكى گېموگلوبىن ۋە گېپارىن)، يېمەكلىك قوشۇمچە ماددىلىرى (ئورگانىك تەركىبلەر، گلىكوگېن، ماي، Ca2+ ئىئونلىرى) ۋە مۇھىتتىكى تەركىبلەردە (فېنول، ئېغىر مېتاللار) مەۋجۇت.

PCR چەكلىگۈچىلىرى باكتېرىيە ۋە ئېۋكارىئوت ھۈجەيرىلىرى، نىشانسىز DNA، توقۇلما ماترىتسىسىنىڭ DNA بىلەن باغلىنىدىغان ماكرومولېكۇلالىرى ۋە قولقاپ ۋە سۇلياۋ قاتارلىق تەجرىبىخانا ئۈسكۈنىلىرىدە كۆپ ئۇچرايدۇ. PCR چەكلىگۈچىلىرىنى چىقىرىۋېتىش جەريانىدا ياكى ئۇنىڭدىن كېيىن نۇكلېئىك كىسلاتانى تازىلاش ئەڭ ياخشى ئۇسۇل.
بۈگۈنكى كۈندە، ھەر خىل ئاپتوماتىك ئېكىستىراكسىيە ئۈسكۈنىلىرى نۇرغۇن قولدا ئىشلەيدىغان قائىدىلەرنىڭ ئورنىنى ئالالايدۇ، ئەمما نىشانلارنى %100 ئەسلىگە كەلتۈرۈش ۋە/ياكى تازىلاش ھەرگىز ئەمەلگە ئاشمىغان. تازىلانغان نۇكلېئىك كىسلاتالاردا يوشۇرۇن چەكلىگۈچىلەر يەنىلا مەۋجۇت بولۇشى ياكى ئاللىبۇرۇن ئۈنۈم بەرگەن بولۇشى مۇمكىن. چەكلىگۈچىلەرنىڭ تەسىرىنى ئازايتىش ئۈچۈن ھەر خىل ئىستراتېگىيەلەر بار. مۇۋاپىق پولىمېرازانى تاللاش چەكلىگۈچى پائالىيىتىگە زور تەسىر كۆرسىتىدۇ. PCR چەكلىگۈچىلىرىنى ئازايتىشنىڭ باشقا ئىسپاتلانغان ئۇسۇللىرى پولىمېرازانىڭ قويۇقلۇقىنى ئاشۇرۇش ياكى BSA قاتارلىق قوشۇمچە ماددىلارنى ئىشلىتىشتىن ئىبارەت.
PCR رېئاكسىيەسىنىڭ چەكلىنىشىنى ئىچكى جەريان سۈپىتىنى كونترول قىلىش (IPC) ئارقىلىق كۆرسىتىشكە بولىدۇ.
ئېتانول، EDTA، CETAB، LiCl، GuSCN، SDS، ئىزوپروپانول ۋە فېنول قاتارلىق ئېكىستراكت قوراللىرىدىكى بارلىق رېئاگېنتلار ۋە باشقا ئېرىتمىلەرنى نۇكلېئىك كىسلاتا ئايرىمىسىدىن پاكىز يۇيۇش باسقۇچى ئارقىلىق چىقىرىۋېتىشكە دىققەت قىلىش كېرەك. ئۇلارنىڭ قويۇقلۇقىغا ئاساسەن، ئۇلار PCR نى ئاكتىپلاشتۇرۇشى ياكى توسۇشى مۇمكىن.